En un estudio reciente publicado en la revista Inmunología, Los investigadores aportan información sobre los orígenes de las células inmunitarias embrionarias y su posterior diferenciación durante el desarrollo del pulmón humano.

Estancia: Desarrollo temprano de células inmunes del pulmón humano y su papel en el destino de las células epiteliales. Crédito de la imagen: u3d/Shutterstock.com

¿Qué sabemos actualmente sobre el desarrollo de la inmunidad fetal y por qué esto no es suficiente?

Investigaciones anteriores han documentado ampliamente las funciones de las células inmunitarias en la regeneración, el mantenimiento de la homeostasis, especialmente en el intestino y los testículos, y el desarrollo del tejido somático. Los estudios tienen como objetivo dilucidar la estructura, los subtipos y la función de las células epiteliales y mesenquimales; Sin embargo, existe una brecha en la comprensión de los investigadores sobre los procesos y las funciones funcionales de las células inmunes en el pulmón.

Las células inmunitarias se encuentran entre las células más importantes responsables de la supervivencia de un bebé desde su nacimiento en adelante. Dadas las defensas que proporcionan las células inmunitarias de la mucosa pulmonar contra los patógenos transmitidos por el aire y las toxinas inhaladas, resulta sorprendente la escasez de literatura actual sobre este tema. Una posible explicación para esta brecha en la literatura puede ser la naturaleza compleja de la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario y la falta histórica de técnicas capaces de rastrear de manera segura estas diferenciaciones durante el embarazo.

Una pregunta crucial que sigue sin respuesta es si las células inmunes pueden tener funciones más allá de la defensa: ¿pueden modular o influir en el crecimiento de los tejidos en los que viven? Responder a esta y otras preguntas similares sobre el desarrollo del pulmón humano a nivel celular y molecular puede dar lugar a nuevas intervenciones clínicas diseñadas para reparar y regenerar los pulmones, proporcionando así a millones o incluso cientos de millones de pacientes una alternativa al trasplante de pulmón.

Investigaciones anteriores han caracterizado la morfología del desarrollo del pulmón humano y han clasificado el proceso en cinco etapas que se superponen temporalmente. Estos consisten en la etapa embrionaria entre cuatro y siete semanas después de la concepción (pcw), la etapa pseudoglandular entre cinco y 17 pcw, la etapa ductal entre 16 y 26 pcw, la etapa quística entre 24 y 38 pcw y ​​la etapa alveolar de Pieza de 36 piezas. PCW hasta los 21 años de edad.

Las primeras tres etapas, específicamente entre el 5 y el 22 de peso, representan el período menos comprendido del desarrollo pulmonar, aunque juntas cubren el desarrollo completo de las células madre epiteliales hasta convertirlas en pulmones semifuncionales.

Sobre el estudio

El presente estudio tiene como objetivo evaluar la progresión temporal del sistema inmunológico fetal y dilucidar su papel potencial en la modulación del desarrollo pulmonar fetal. Las muestras embrionarias y fetales humanas se obtuvieron de una subvención conjunta de MRC/Wellcome Trust Human Developmental Biological Resources (HDBR).

Los embarazos que terminaron entre el 5 y el 22 WT se utilizaron para obtener tejido pulmonar nuevo con el consentimiento por escrito de los donantes. Se realizó un análisis de cariotipo para garantizar que las muestras incluidas estuvieran libres de anomalías genéticas y representaran un desarrollo fetal humano “típico”.

La inmunohistoquímica (IHC) del tejido pulmonar se ha utilizado para validar los tipos y la cantidad de células inmunitarias durante las tres primeras etapas del desarrollo pulmonar embrionario. El análisis IHC también contribuyó a la evaluación de las ubicaciones de las células inmunes observadas y sus diferencias de cinco a 22 peso.

Para mejorar la precisión y confiabilidad de la cuantificación de células inmunes, se realizó una cuantificación 3D mediante microscopía confocal seguida de análisis del software Imaris. Las imágenes 3D calculadas se compararon con las imágenes 2D en cada momento durante la duración del estudio.

Se utilizó digestión de tejido pulmonar seguida de citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para validar las estimaciones de IHC y dilucidar las proporciones relativas de CD3.⁺disco 4⁺,CD8⁺Células T reguladoras (T_Grabaciones) como porcentaje de CD45⁺ Poblaciones de la misma etapa de desarrollo, clasificación CD45.⁺ Células como precursoras de la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-sq).

Además, scRNA-sq cumplió el doble propósito de validar los resultados de la citometría de flujo y la caracterización molecular de las células inmunes en todas las muestras. Además, se utilizó la indexación celular de transcripciones y la secuenciación de epítopos (CITE-seq) para mejorar la precisión de los resultados.

Los organoides pulmonares fetales humanos también se han utilizado en experimentos de caracterización funcional, incluidos tratamientos con citocinas, ensayos transcripcionales de inhibidor dual materno de hemiplejía (SMAD), macrófagos, cultivos de células dendríticas (DC) y matrices de citocinas.

Todos los datos obtenidos se sometieron a análisis estadísticos que consistieron en un análisis de varianza no apareado, de dos colas y unidireccional (ANOVA). pruebas tanálisis de máxima verosimilitud residual (REML) y prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey.

Resultados

Los ensayos de scRNA-seq, IHC y organoides funcionales revelaron que las poblaciones de células inmunitarias difieren significativamente entre las etapas del desarrollo fetal. Las células inmunitarias progenitoras e innatas, incluidas las células mieloides y linfoides innatas (ILC) y las células asesinas naturales (NK), predominaron en las primeras etapas del desarrollo, pero fueron reemplazadas gradualmente por linfocitos T y B. CD45⁺ Las células eran casi ubicuas en todas las etapas de desarrollo y en todas las regiones tisulares asociadas con el pulmón; Sin embargo, su cantidad relativa varía a lo largo del tiempo y el espacio.

La caracterización molecular de las células inmunes reveló 77.559 archivos transcripcionales, de los cuales 61.757 eran nuevos para la ciencia. La anotación de estos perfiles seguida de análisis de grupos reveló 59 grupos que representan todas las clases de células inmunes conocidas. Los análisis de los progenitores de estas clases llevaron al descubrimiento de una densidad inesperadamente alta de ILC y progenitores linfoides tempranos (ELP).

En conjunto, estos resultados indican que las células inmunitarias siguen un patrón bifásico durante el desarrollo fetal y su abundancia aumenta significativamente durante el octavo y el vigésimo período de peso. Las evaluaciones cuantitativas de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) sugieren que el pico de 20 WT puede deberse en parte a la maduración vascular.

La maduración de las células B en los pulmones se detectó por primera vez mediante ensayos de IHC y de hibridación in situ con fluorescencia de molécula única (smFISH). Esto se suma a un creciente cuerpo de evidencia de que la médula ósea no es la única fuente de células B maduras, lo que contradice creencias científicas anteriores.

La expresión del isotipo Ig combinada con ensayos de expansión clonal reveló que durante el desarrollo, el mesénquima y el epitelio apoyan la homeostasis de las células B mediante la secreción de quimiocinas canónicas, incluida CCL28.

El resultado colectivo de los ensayos transcriptómicos y de citocinas ha revelado las interacciones complejas de múltiples citocinas secretadas por células inmunes, que a su vez han sido validadas funcionalmente para influir en la diferenciación de las células epiteliales. Estos resultados indican que las células inmunes tienen un doble propósito, a saber, la defensa y el desarrollo pulmonar durante el desarrollo fetal, lo que confirma hipótesis anteriores.

Conclusiones

En este estudio, los investigadores combinaron análisis transcriptómicos de última generación con IHC para dilucidar las funciones estructurales y funcionales de las células inmunitarias durante el desarrollo embrionario y fetal. Las evaluaciones de células inmunes fetales de 5 a 33 PCS revelaron que la maduración completa de las células B ocurre en los pulmones fetales, desafiando la creencia común de que la médula ósea es la única fuente de poblaciones de células B maduras.

Se ha descubierto que la interleucina-1 beta (IL-1β) es producida ampliamente por células mieloides que circulan ampliamente. A su vez, se descubrió que la IL-1β modula y promueve la diferenciación de las células madre epiteliales, destacando el papel dual de las células inmunitarias tanto en la defensa como en el desarrollo epitelial pulmonar.

En conjunto, estos hallazgos proporcionan un atlas inmunológico de los pulmones humanos en desarrollo y sugieren un papel de las células inmunes fetales en la dirección del desarrollo epitelial pulmonar.