febrero 26, 2021

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O-glicosilación de la proteína pico del SARS-CoV-2 en insectos y líneas celulares humanas

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Los sitios de O-glicosilación en una proteína de pico estaban cerca de los N-glicositos, lo que indica que los O-glicanos complementaron el efecto de los N-glicanos en la protección inmunológica.

El síndrome respiratorio agudo severo 2 por coronavirus (SARS-CoV-2), la causa de la pandemia COVID-19, tiene algunas características que no hemos visto antes en los coronavirus humanos, como una mutación en el dominio de unión al receptor (RBD) que afinidad con la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2) y la presencia del sitio de división de furina entre dos subunidades de la proteína de pico.

Actualmente se han aprobado varias vacunas para su uso y muchas se encuentran en ensayos clínicos. Algunas vacunas son formulaciones de monocitos que utilizan proteínas virales recombinantes para la inmunización.

Cuando los virus envueltos se mueven a través de la vía secretora, pueden adquirir un hospedador de glicosilación. La glicosilación puede modificar la forma de las moléculas de proteína, proteger los aminoácidos y así evitar que sean reconocidos por el sistema inmunológico del huésped.

Hay dos tipos de glicosilación humana importantes para envolver virus como el SARS-CoV-2: unión a glicosilación ligada a N y unión a glicosilación ligada a mucina, que se desencadena por glicosilación de polipéptidos (GalNAc-Ts) y modificación de algunos aminoácidos .

Se han utilizado varias proteínas y sistemas de expresión para conocer la estructura y las modificaciones postraduccionales de la proteína de pico del SARS-CoV-2, y algunas también se han estudiado como vacuna candidata. Sin embargo, no es fácil predecir los eventos de glicosilación y los sitios exactos de los O-glicanos.

El mapeo de O-glicositos requiere herramientas que puedan soportar la fragmentación de la descomposición por transporte de electrones (ETD). En un nuevo estudio publicado en bioRxiv* Preimpresión del servidor, los investigadores informaron sus hallazgos sobre si los patrones de glicosilación o de unión a O influyen en los inmunomoduladores del desarrollo de vacunas.

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Patrones de glicosilación en insectos y líneas celulares humanas

Usando un método desarrollado previamente por el equipo para mapear glicositos, compararon patrones de unión de O-glicosilación en proteínas de pico expresadas en Mosca de la fruta Y células HEK. Utilizando la disociación inducida por colisión por transporte de electrones (ETciD) y la fragmentación de MS2 de CID (HCD) de alta energía, el equipo identificó los sitios donde se modificaron los aminoácidos. Encontraron diez glicositos diferentes en la proteína de pico expresada en HEK. De estos, siete eran idénticos a los del dominio externo del insecto.

Los patrones de unión a la glicosilación O fueron similares en las múltiples bandas externas de las diferentes líneas celulares. Sin embargo, los patrones de O-glicosilación de RBD en el monómero y el dímero de insecto fueron todos diferentes. Los autores encontraron que la mayoría de los O-glicositos estaban presentes cerca o solo dentro de las secuencias NXS / T en la N-glicosilación. En total, el equipo identificó 25 O-glucositas, de las cuales 16 estaban contenidas en los tres aminoácidos de las N-glucositas.

Usando el software, el equipo luego mapeó los O-glicositos que identificaron en una estructura de proteína de altura completa completamente glicosilada. La mayoría de las O-glucositas se asignaron a aminoácidos que podían acceder fácilmente a los disolventes. Para ambas líneas celulares, se encontraron O-glicanos uniformemente sobre la superficie expuesta, mezclados con N-glicanos.

O-glicosilación de una proteína SARS-CoV-2 elevada expresada en insectos o células humanas. (A) Estrategia empírica. (B) Mapeo gráfico de una secuencia de proteína de pico anotada por sitios de unión de oglicosilación definidos usando espectrometría de masas Orbitrap Lumos con fraccionamiento ETD y HCD MS2. Los O-glicositos se determinan independientemente en una escala exógena derivada de HEK 293F usando un espectrómetro de masas Q Exactive HF-X con fraccionamiento HCD MS2 con contornos naranjas. (C) Tabla que resume los O-glicositos y estructuras relacionadas que se encuentran en diferentes formulaciones S (rectángulos amarillos). Los sitios ambiguos aparecen como rectángulos fusionados en varias ubicaciones. No aplica – no aplica; “-” – no detectado. Los sitios derivados de Orbitrap Fusion Lumos están marcados con contornos grises. Los sitios adicionales identificados en el ectodominio HEK 293F con Q Exactive HF-X están marcados con contornos naranjas. (D) Ejemplos de O-glicopéptidos identificados con Orbitrap Fusion Lumos usando fraccionamiento ETD. Los fragmentos de iones producto de MS2 cyz se anotan en función de los respectivos espectros ETD

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Los O-glicanos probablemente complementan a los N-glicanos en la protección inmunológica

Patrones de glicosilación similares en líneas celulares de humanos e insectos indican que las isoformas de GalNAc-Ts pueden precipitar péptidos glicosilados. Los autores encontraron que más del 60% de los sitios de O-glicositos estaban muy cerca de los sitios de N-glicositos. Un análisis adicional reveló que estaban presentes O-glucositas en péptidos con asparagina que no fueron modificados por N-glucanos. En siete de las nueve regiones examinadas, más del 85% de los péptidos no N-glicosilados estaban O-glicosilados, lo que indica que las regiones que no estaban N-glicosiladas estaban O-glicosiladas. Es posible que los O-glicanos protejan los fragmentos de péptidos que no están ocupados por N-glicanos.

El análisis reveló además que los O-glicositos tienen baja ocupación, pero que esta baja ocupación junto a los N-glicositos es consistente con los informes publicados sobre N-glicosilación con alto contenido de proteínas. Es poco probable que un número bajo de O-glicositos afecte la función de la proteína o inmunitaria, y es poco probable que se relacione con las formulaciones inmunomoduladoras de la proteína con alto contenido de nitrógeno.

El modelado molecular sugirió que los nucleicanos y el oxígeno a menudo se dirigían más lejos el uno del otro. Sería útil comprender si el proceso de mutagénesis en sitios específicos asociados con nucleicanos aumentaría los O-glicanos en estas regiones. Además, la investigación de la abundancia de O-glicanos en virus con menos glicosilación densa de población también explicará cómo la glicosilación afecta la protección inmunológica.

Por tanto, aunque los O-glicanos son una parte menor del escudo de los glicanos de proteína espinosa, juegan un papel importante en la ocupación de áreas no cubiertas por la N-glicosilación y potencialmente complementan el efecto de los N-glicanos en la protección inmunológica.

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*Nota IMPORTANTE

bioRxiv Publica informes científicos preliminares que no han sido revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, que dirigen la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud, ni deben tratarse como información estática.

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